دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، دانشکده علوم دریایی، گروه زیست شناسی دریا ، s_matroodi@yahoo.com
چکیده: (2690 مشاهده)
پیشینه و اهداف:آنزیم‌ها پروتئین‌هایی هستند که به‌طور انتخابی تمام واکنش‌های متابولیک را در موجودات زنده کاتالیز می‌کنند. میلیون‌ها آنزیم توسط پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها تولید می‌شوند. اسفنج‌های دریایی با ارگانیسم‌های مختلفی مانند باکتری‌ها، قارچ‌ها، ویروس‌ها، پروتوزوآها و موجودات تک سلولی بنام جلبک‌ها همزیستی دارند و طبیعت میان‌کنش اسفنج‌ها با میکروب‌ها بسیار متنوع است.حدود 40 درصد از حجم توده اسفنج از باکتریهای همزیست تشکیل شده است. حداقل 32 شاخه باکتریایی در اسفنج‌های دریایی شناخته شده است که توسط روش‌های وابسته به کشت و مستقل از کشت جداسازی شده‌اند. میکروارگانیسم‌های همزیست با اسفنج‌ها منبع ترکیبات مختلفی هستند که در گذشته گمان می‌رفت توسط اسفنج‌ها تولید می‌شوند که اکنون مشخص شده که توسط این میکروارگانیسم‌های همزیست مشتق شده‌اند. چنانچه باکتریهای تولیدکننده این ترکیبات جداسازی شوند می‌توان جهت تولید انبوه آنها را کشت داد. هدف از این تحقیق جداسازی باکتریهای تولیدکننده آنزیم آمیلاز از اسفنج‌های دریایی و بهینه‌سازی شرایط رشد و تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر می‌باشد. باکتریهای همزیست با اسفنج با استفاده از روش رقیق‌سازی سریالی و آنالیزهای افتراقی در باکتریهای جداشده انجام شد. فعالترین ایزوله با استفاده از روش‌های کیفی و کمی هیدرولیز نشاسته انتخاب شد. روش‌ها:ویژگی‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی با استفاده از کتاب برجی و سیستماتیک باکتری‌ها انجام شد. آنالیزهای افتراقی با انجام تست‌های کاتالاز، گرم، TSI، سیمون سیترات، اورنیتیل دکربوکسیلاز، لیزین دکربوکسیلاز، VP، MR، ایندول و SIM انجام شد. غربالگری اولیه جهت جداسازی ایزوله‌های تولیدکننده آنزیم آمیلاز به ترتیب، با انجام آزمایش‌های پلیت حاوی نشاسته و دینیتروسالیسیلیک اسید (DNS) صورت گرفت. جهت بهینه‌سازی تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر (SS1) با استفاده از محیط کشت M1 حاوی غلظت‌های مختلف NaCl (2 تا 14 درصد)انجام شد. برای یافتن pH بهینه از محیط کشت M1 با pH های مختلف 4تا 8 استفاده شد و پس ازگذشت زمان انکوباسیون فعالیت آمیلازی آنها مورد آزمایش قرار گرفت. ایزوله SS1 در محیط کشت M1 در 28 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز جهت تهیه توده سلولی مناسب برای استخراج DNA کشت داده شد. استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA از باکتریهای گرم مثبت، انجام شد. تکثیر ژن 16S rRNA با استفاده از DNA استخراج شده و آغازگرهای F27 و R1492 انجام شد. محصول PCR به دست آمده توالی یابی شده و توالی‌ها مورد بررسی قرار گرفت. توالی ژن 16S rRNA به دست آمده با استفاده از نرمافزار BLAST موجود در داده پایگاه ژنی NCBI همردیف شد و در سطح جنس با استفاده از نرم افزار CLUSTAL-X شناسایی شد. درخت فیلوژنی با استفاده از نرمافزار MEGA 6.06 و روش Neighbor-Joiningرسم گردید. صحت درخت فیلوژنی با بوت استرپ 1000 تکرار صورت گرفت. یافته‌ها:آنالیزهای بیوشیمیایی نشان داد که هر سه ایزوله کاتالاز و گرم مثبت هستند و هیچکدام H2S تولید نمی‌کنند. تمام ایزوله‌ها برای آزمایش‌های TSI، MR و VP منفی بودند. توالی‌های 16S rRNA بدست آمده از فعالترین ایزوله تولیدکننده آنزیم آمیلاز نشان می‌دهد که این ایزوله متعلق به جنس باسیلوس می‌باشد. شرایط بهینه رشد و تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر به شرح زیر می‌باشد: غلظت 12 درصد NaCl، دمای 35 درجه سانتیگراد و pH 12 می‌باشد. بیشترین فعالیت آمیلازی مشاهده شده در شرایط بهینه رشد ایزوله برتر مورد مطالعه 109 واحد آنزیمی بود (هر واحد آنزیمی عبارتست از میزان آنزیمی که یک میکروگرم گلوکز را در یک دقیقه آزاد کند). نتیجه‌گیری:نتایج نشان می‌دهند که تولید آنزیم به شرایط رشد باکتری بستگی دارد و در مطالعات بعدی لازم است ژن کدکننده آنزیم آمیلاز تکثیر و جهت تولید انبوه آنزیم در میزبان مناسب کلون شود.
